DLSで測る粒子径、顕微鏡と値が違う理由

同じナノ粒子について、電子顕微鏡では50 nm、DLSでは80 nmという結果が出たとします。これは説明のための仮の数値ですが、どちらかを誤差として片付ける前に、二つの方法が何を「大きさ」と呼んでいるかを確かめる必要があります。

DLS（動的光散乱）は、液中で動く粒子が散らす光を調べ、その動きやすさから粒径を求める方法です。輪郭を撮影する電子顕微鏡とは、測る物理量も、平均への寄与の仕方も違います。NISTとNCLの2015年改訂プロトコルをもとに、希薄な水系分散液の結果を比較するときの読み方を整理します。^{［1、pp.1、7–9］}

光の揺らぎから、液中での動きやすさを求める

液中の小さな粒子は、ブラウン運動によって不規則に動いています。DLSでは、粒子の動きに伴う散乱光の強度の揺らぎを記録し、ある時点の信号と、少し時間を置いた信号との似かより方を調べます。この時間的な相関の減り方から、粒子がどの程度広がっていくかを表す拡散係数を求めます。粒子を一つずつ撮影して、その移動距離を追う測定ではありません。^{［1、pp.12–13］}

次に、拡散係数をStokes–Einstein式へ入れます。流体力学径を d_H、拡散係数を D とすると、関係は d_H = kT / (3πηD) です。k はボルツマン定数、T は絶対温度、η は分散媒の粘度です。同じ温度と粘度なら、拡散が遅いほど大きな径として換算されます。^{［1、p.8］}

ここでいう流体力学径は、測定した粒子と同じ速さで拡散する、等価な硬い球の直径です。実際の粒子が球であることや、その最も長い部分を測っていることを意味しません。液中での動きやすさを、一つの長さで表した値です。

電子顕微鏡の画像から求める寸法は、投影された形などに基づきます。したがって、冒頭の50 nmと80 nmの差だけでは、粒子が膨らんだとも、装置が30 nmずれたとも決められません。まず、顕微鏡側ではどの寸法を集計し、DLS側ではどの解析値を報告したかを確認します。^{［1、pp.1、7］}

少数の大きな粒子が、平均を動かす

もう一つの違いは、平均を作るときの重みです。顕微鏡画像から粒子を数えて個数平均を求める場合、一つの粒子は一票として扱われます。一方、DLSでは散乱光の強さが効くため、大きな粒子の寄与が強くなります。NISTのプロトコルも、少数の大きな粒子や、小さな粒子が集まったクラスターにDLSが敏感であると説明しています。^{［1、pp.4、7］}

十分に小さな粒子について、材質や周囲の媒質などの条件が同じで、散乱強度が直径の6乗に比例する近似を使える場合を考えます。直径が2倍なら、一粒当たりの散乱強度は2の6乗、つまり64倍になります。これは重みの違いを示す計算例です。粒径や光学条件を問わず64倍になるわけでも、DLSの平均径を単純に64倍の重みで足し合わせればよいわけでもありません。^{［1、pp.4、8–9］}

このため、多くの小粒子に少数の凝集体が混ざっていると、DLSの値と、顕微鏡で多数見つかる小粒子の寸法が離れることがあります。顕微鏡にも、観察した視野や選んだ粒子が試料全体を代表しているかという問題があります。DLSで大きい値が出たから凝集と断定するのではなく、少数の大粒子を含むか、画像で十分な数と範囲を調べたかを対応させて読みます。^{［1、p.7］}

温度と粘度は、測定後の計算にも入っている

粒子の動きやすさは、粒子だけで決まりません。周囲の液体の粘り気が強いか、どの温度で測ったかにも左右されます。拡散係数を径へ換算する式に粘度と温度が入るため、試料に合わない値を入力すれば、換算された粒径も変わります。

プロトコルの物性表では、純水の粘度は20 ℃で1.002 mPa·s、25 ℃で0.890 mPa·sです。「水に分散させた」という情報だけでは、計算に使う粘度は決まりません。また、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に分散した試料へ純水の粘度を使うと、室温では粘度の入力に約2％の差が生じると説明されています。これは粒子が変わったこととは別の、換算条件の違いです。^{［1、pp.8–9］}

分散媒の組成は、入力値を通じてだけでなく、粒子の動きそのものにも影響します。帯電した粒子では、周囲の電気二重層が拡散に関わり、塩濃度によって見かけの流体力学径が変わる場合があります。逆に、塩を増やしすぎると分散が不安定になり、凝集を起こすこともあります。試料ごとに、分散媒の条件と安定性を確かめる必要があります。^{［1、pp.3–4］}

濃すぎる試料では、光が複数回散乱したり、粒子同士が相互作用したりします。しかし、薄めれば必ず本来の径が得られるわけではありません。純水を加えるだけの希釈では、粒子濃度と同時に塩濃度なども変わるためです。資料は、複数の濃度で結果を比べることに加え、組成を合わせた分散媒などで希釈する考え方を示しています。濃度の影響を調べたいなら、媒質まで変えてしまっていないかを分けて確認します。^{［1、pp.3–4］}

z-averageと分布のピークは、同じ値ではない

DLSの結果にある「z-average」は、相関データをキュムラント法で解析して求める平均径です。光を強く散らす成分の寄与を含む値で、画像から数えた粒子径の単純な算術平均とは異なります。同時に得られる多分散指数（PI、PDI）は、広がりを表す量です。キュムラント法だけで、粒径分布の形や複数の山が直接得られるわけではありません。^{［1、pp.9、14］}

装置ソフトウェアが分布のグラフも表示している場合は、使った解析法と、強度・体積・個数のどれで重みを付けた分布かを見ます。強度分布から個数分布へ変換した結果は、顕微鏡で粒子を直接数えた結果そのものではありません。変換に用いた光学モデルや入力値が加わっています。

ここでは、二種類の屈折率も区別が必要です。分散媒の屈折率は、拡散係数を求める計算に使います。一方、粒子の屈折率は、強度で重み付けした分布を体積・個数の分布へ変換するときに必要となります。入力する粒子の屈折率は、拡散係数やz-averageを求める計算自体には使いません。入力欄を一括して「屈折率」と見ると、どの結果に影響する値なのかが分かりにくくなります。^{［1、pp.8–9］}

値の違いを、材料の違いへ結び付けるには

ロット間の粒径を比べるなら、まず同じ測定量を比べます。DLSのz-average同士なのか、同じ方法で数えた顕微鏡画像の粒子径同士なのか。次に、分散媒の組成、温度と粘度、試料濃度、解析法、測定の繰り返しとばらつきをそろえて読みます。これらを伴わない「平均80 nm」だけでは、材料の差と測定条件の差が重なったままです。^{［1、pp.9–10］}

大きな成分が現れたときには、異物の混入と、試料自身の凝集も区別します。ろ過で大きな成分を取り除けば結果は変わりますが、それが除きたかったほこりなのか、測定対象の一部なのかを確かめなければなりません。プロトコルは、フィルターが対象粒子を取り除いたり変えたりしないことを、試料ごとに検証するよう求めています。^{［1、pp.2、4–5］}

また、測定中に粒子が沈んでいく試料を、ブラウン運動で分散し続ける粒子と同じ前提で扱うことはできません。資料は、測定後に底へ沈殿が見える場合には結果を採用せず、対象に適した別の方法を検討するよう説明しています。^{［1、p.6］}

DLSと顕微鏡を組み合わせる意味は、同じ数値になるまで条件を調整することにはありません。液中での動きやすさと、画像から分かる形・寸法を対応させ、差を生む要因を絞ることにあります。測った量、平均の重み、媒質と試料の状態を分けて見れば、「値が違う」という結果から、次に確かめるべき条件が見えてきます。

参考資料

1. V. A. Hackley、J. D. Clogston『Measuring the Size of Nanoparticles in Aqueous Media Using Batch-Mode Dynamic Light Scattering』、NIST Special Publication 1200-6／NIST–NCL Joint Assay Protocol PCC-1、Version 1.2、2015年5月改訂。DOI: 10.6028/NIST.SP.1200-6。本文の頁表記を使用。定義はp.1、分散・濃度・清浄度はpp.3–6、他手法との比較はp.7、解析・入力値と報告条件はpp.8–10、用語はpp.12–14を参照。